mRNA疫苗在covid-19疫情出圈后，基于mRNA開(kāi)發(fā)新療法更加受到關(guān)注，包括mRNA傳染病疫苗、腫瘤免疫療法（癌癥疫苗）、治療性蛋白質(zhì)替代療法和遺傳疾病治療等。 

基于mRNA技術(shù)的covid-19廣泛使用。目前，全球范圍內(nèi)已有2種mRNA疫苗獲得FDA的EUA（緊急使用授權(quán)），分別是由德國(guó)BioNTech、輝瑞和復(fù)星醫(yī)藥共同研發(fā)的BNT162b2（有效率95%）以及美國(guó)Moderna公司研發(fā)的mRNA-1273（有效率94.1%）。

在國(guó)內(nèi)，由沃森生物、蘇州艾博生物、軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院共同研制的mRNA covid-19ARCoV將于5月30日起在墨西哥開(kāi)始III期試驗(yàn)；斯微生物的mRNA疫苗也進(jìn)入了I期臨床試驗(yàn)。

既然mRNA疫苗這么受歡迎，今天我們就來(lái)講講mRNA疫苗是如何體外制備的。

mRNA疫苗的制備

以covid-19為例，我們首先分離出病毒株，測(cè)序及分析獲得病毒的完整基因序列，然后通過(guò)基因工程技術(shù)，利用化學(xué)合成的方式，合成S刺突蛋白所對(duì)應(yīng)的病毒RNA片段，為了方便接下來(lái)的RNA大量復(fù)制，RNA片段首先在DNA聚合酶的作用下，發(fā)生逆轉(zhuǎn)錄合成雙鏈DNA結(jié)構(gòu)。在基因克隆技術(shù)中，通常將要復(fù)制的DNA嵌入到載體質(zhì)粒中，利用細(xì)菌快速繁殖，培養(yǎng)，復(fù)制出大量嵌入S蛋白DNA質(zhì)粒的細(xì)菌，經(jīng)過(guò)提取，分離，純化等工藝，得到大量純凈S蛋白DNA。S蛋白DNA通過(guò)使用轉(zhuǎn)錄試劑完成體外轉(zhuǎn)錄得到大量mRNA,mRNA單獨(dú)存在時(shí)結(jié)構(gòu)并不穩(wěn)定，所以在最終制成疫苗時(shí)，需要在mRNA外層包裹一層脂類(lèi)，最終完成mRNA疫苗的制備。

mRNA的結(jié)構(gòu)及優(yōu)化策略

1 mRNA加帽

真核細(xì)胞mRNA的5'端有一個(gè)帽子結(jié)構(gòu)，它是在mRNA轉(zhuǎn)錄后，由甲基化的鳥(niǎo)苷酸（m7G）經(jīng)焦磷酸化與mRNA的5'端核苷酸相連。5'端帽子結(jié)構(gòu)在mRNA許多生物學(xué)功能中起到重要的作用，這包括：mRNA的剪切、穩(wěn)定、轉(zhuǎn)運(yùn)和核糖體的募集等。由于5'端帽子結(jié)構(gòu)的重要生物學(xué)功能，在mRNA疫苗研發(fā)過(guò)程中需要優(yōu)化5'端帽子結(jié)構(gòu)，并利用合適的工藝對(duì)mRNA原料進(jìn)行“加帽”。

mRNA疫苗產(chǎn)品的加帽可以在mRNA的體外轉(zhuǎn)錄過(guò)程中通過(guò)摻入“帽子序列”實(shí)現(xiàn)，這種加帽技術(shù)會(huì)將加帽序列反向加在mRNA上，這會(huì)導(dǎo)致約1/3的加帽失敗。通過(guò)摻入特殊的帽子結(jié)構(gòu)——“anti-reverse”帽子結(jié)構(gòu)（ARCA）可以降低這種反向加帽失誤的出現(xiàn)。另外，還可以先合成不帶帽子結(jié)構(gòu)的mRNA，再利用痘病毒的“加帽復(fù)合物”對(duì)mRNA進(jìn)行加帽，這也是一種mRNA的加帽手段。

2.非翻譯區(qū)序列（UTRs）修飾

在mRNA的編碼區(qū)兩端各存在一段非翻譯區(qū)（UTRs），在5'端的被稱(chēng)為5'端UTR，在3'端的被稱(chēng)為3'端UTR。

非翻譯區(qū)序列不是密碼子，不能翻譯成氨基酸，但是可以通過(guò)RNA結(jié)合蛋白控制mRNA產(chǎn)品的降解和轉(zhuǎn)錄效率。因此，每一種mRNA疫苗都需要考慮如何設(shè)計(jì)產(chǎn)品的UTR組件，進(jìn)而提高在目的細(xì)胞中mRNA疫苗的穩(wěn)定性和轉(zhuǎn)錄效率。大量的研究發(fā)現(xiàn)非洲爪蟾和人源的α-球蛋白/β-球蛋白的UTR序列非常穩(wěn)定，而且能夠增加異源的mRNA的表達(dá)效率，因此這兩個(gè)蛋白的UTR原件通常被設(shè)計(jì)為mRNA疫苗的UTR組件。當(dāng)然，也有其它蛋白的UTRs被研究用于mRNA疫苗的組件，在此不再贅述。

3.Poly（A）

大多數(shù)真核生物的mRNA 的3'端都有由100~200個(gè)腺苷酸聚合形成的Poly（A）尾巴。mRNA的Poly（A）尾巴可以和5'端帽子結(jié)構(gòu)共同合作，增強(qiáng)mRNA結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性。Poly（A）尾巴首先和大量的Poly（A）結(jié)合蛋白（PABP）結(jié)合，然后募集真核生物起始因子4G（eIF4G），增加Poly（A）跟5'端帽子結(jié)構(gòu)的親和力，最終mRNA的Poly（A）尾巴和5'端帽子結(jié)構(gòu)首尾相接，形成環(huán)裝mRNA。環(huán)裝mRNA結(jié)構(gòu)有利于核糖體的募集，其特殊的結(jié)構(gòu)也能保護(hù)mRNA不被降解。

在mRNA體外合成過(guò)程中，Poly（A）尾巴可以通過(guò)質(zhì)粒DNA模板轉(zhuǎn)錄獲得，也可以先合成mRNA再通過(guò)Poly（A）聚合酶加上不同單位數(shù)量的尾巴。前者能夠在mRNA產(chǎn)品中加入特定數(shù)目的Poly（A），而后者加入的單位數(shù)不確定。

Poly（A）尾巴的單位數(shù)目對(duì)于其生物學(xué)作用起到了至關(guān)重要的作用。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)，活躍表達(dá)的mRNA包含的Poly（A）序列的長(zhǎng)度為100-250個(gè)。有研究發(fā)現(xiàn)，表達(dá)效率越高的mRNA，其Poly（A）尾巴越短。但是當(dāng)Poly（A）單位長(zhǎng)度小于12時(shí)，mRNA結(jié)構(gòu)就不再穩(wěn)定，容易被降解。在設(shè)計(jì)mRNA疫苗產(chǎn)品的序列時(shí)，Poly（A）的長(zhǎng)度也是非常重要的優(yōu)化指標(biāo)。

4. 開(kāi)放閱讀框

開(kāi)放閱讀框（Open Reading Frame, ORF）包涵了mRNA的全部編碼序列，負(fù)責(zé)進(jìn)入人體后表達(dá)mRNA運(yùn)載的抗原靶蛋白。

密碼子水平的修飾，利用常用的密碼子，選用tRNA較多的密碼子；使各個(gè)密碼子的比例更接近靶物種或者細(xì)胞的比例；

GC含量的修飾，避免復(fù)雜二級(jí)結(jié)構(gòu)形成；二級(jí)結(jié)構(gòu)對(duì)mRNA的延伸和轉(zhuǎn)錄非常重要，高穩(wěn)定的二級(jí)結(jié)構(gòu)和發(fā)夾結(jié)構(gòu)需要避免。這樣的二級(jí)結(jié)構(gòu)可以阻止核糖體的進(jìn)入、掃描以及容易被先天性免疫識(shí)別為PAMP。

mRNA疫苗制備試劑盒：

Cellscript   T7 mScript™ Standard mRNA Production System  C-MSC11610/C-MSC100625

該試劑盒包含T7 RNA聚合酶，加帽酶，加尾酶，以及2'-O-甲基轉(zhuǎn)移酶， 可以一站式解決mRNA制備過(guò)程。

T7-FlashScribe™ Transcription Kit  C-ASF3507  以1ug線(xiàn)性化的DNA為模板，在30min內(nèi)體外轉(zhuǎn)錄可以得到180ug的RNA。

其他相關(guān)產(chǎn)品

北京和一生物作為Cellscript的國(guó)內(nèi)授權(quán)代理，為你提供CellScript公司全套的mRNA生產(chǎn)的原料，目前產(chǎn)品主要包括體外轉(zhuǎn)錄試劑盒，帽類(lèi)似物，加帽酶，加尾酶，以及一些修飾核苷等等，北京和一生物為你提供全套mRNA制備的解決方案，助力抗擊covid-19，期待你的咨詢(xún)！